上海交大张洪斌Macromolecules：冷冻-解冻诱导的透明质酸凝胶化：与分子间相互作用及分子构象相关的冷冻结构化物理过程

【引言】

透明质酸（HA）是脊椎动物体内普遍存在的最重要的糖胺聚糖，由包含(1→4)-β-D-葡萄糖醛酸和(1→3)-β-D-N-乙酰葡萄糖胺重复二糖单元构成的直链大分子，在细胞信号传导、创伤修复、形态建成、基质构造等多种生物过程中发挥着重要作用。近年来，科学家们通过采用HA修饰不同的纳米材料如金、银、磁性纳米颗粒、碳材料和介孔材料等，实现了它们在特定细胞与组织中的良好分布。这些HA功能纳米材料在生物技术及生物医药领域具有广阔应用：可作为纳米载体参与药物运输、作为造影剂参与分子成像，亦可作为诊断剂参与癌症治疗，等等。除上述重要生理功能外，HA水溶液的粘弹性也十分重要。鉴于HA具有良好的生物相容性、可生物降解性和非免疫原性，HA是构筑具有特定形态、刚度和生物活性水凝胶的优良备选材料，在关节炎治疗、术后粘连预防、伤口敷料、支架材料、药物传输、组织修复与再生等领域均具有巨大应用价值。
迄今，大多数HA基的水凝胶通过化学交联的方法进行制备。然而，在这种制备方法中，交联剂和有机溶剂的使用以及终产物含反应副产物的情况难以避免，这些问题很可能对HA的生物相容性造成不利影响，从而影响HA在生物医药领域中的短期及长期应用。

利用氢键作用、疏水作用及离子相互作用等非共价作用能有效构筑物理交联的水凝胶，从而在一定程度上解决化学法制备的水凝胶存在的问题。尽管HA是公认的非凝胶多糖，但可通过冷冻-解冻方法在pH较低的条件下制备HA的物理凝胶。Okamoto和Miyoshi首先采用了该方法。这种非共价冷冻结构化过程具有制备条件温和、无需采用有机溶剂和有毒交联剂的优点。

HA冷冻-解冻物理凝胶形成的一般机制为：水溶液冷冻凝固时发生相分离，使得大分子高浓度富集相中分子链被强制排列，进而形成并行联结结构而形成交联区，该交联结构在解冻过程仍能保持。然而HA冷冻凝胶网络结构中的连接方式与一些关键影响因素（如分子尺寸、加工步骤、分子构象等）对凝胶化的作用一直以来不清晰，HA分子中羟基、羧基和乙酰氨基对凝胶网络结构形成的贡献有待阐明。

【成果简介】

近日，上海交通大学张洪斌研究员（通讯作者）等人通过冷冻-解冻方法在低pH条件下制备了HA物理交联水凝胶，并对加工过程（包括冷冻时长、冷冻-解冻过程的循环次数等）、HA的分子量、多羧基及多羟基小分子的加入等因素对HA冷冻水凝胶形成的影响进行了探究，揭示了酸性和中性凝胶网络的详细结构。该工作以“Freeze-Thaw-Induced Gelation of Hyaluronan: Physical Cryostructuration Correlated with Intermolecular Associations and Molecular Conformation”为题于2017年7月28日发表在期刊Macromolecules上。

【图文导读】

图1：HA冷冻-解冻物理凝胶网络结构中分子间相互作用模型。

（A）酸性冷冻凝胶分子间键合情况；

（B）中性冷冻凝胶分子间键合情况；

（C）加入二元羧酸的酸性冷冻凝胶分子间键合情况。

图2：HA冷冻凝胶制备过程中HA分子链不同形态示意图

溶液中的天然HA表现为“刚性”无规卷曲。Martens等提出多重螺旋链段和扁平链段两种链段与不同构象共存。酸化后，通过排出HA中的羧基对分子间和分子内静电排斥进行筛选，发现HA链处于扁平链构象并发生缠结。在冷冻凝胶制备过程的冷冻步骤中，分子链中的许多螺旋构象部分通过与高浓度未凝固相中的其他分子链相关联、转变为扁平链构象。

【小结】

本文中，研究人员为进一步了解HA凝胶化过程的机制、控制HA冷冻凝胶物化性质，对冷冻时长、冷冻-解冻循环的次数、HA分子尺寸、多羧基或多羟基小分子的加入等因素对冷冻凝胶化及HA最终性能的影响进行了研究，并提出一种新的HA冷冻凝胶的凝胶机制及分子间相互作用模式。
HA冷冻凝胶化过程是一个物理低温结构化过程。本研究表明，冷冻凝胶的物化性质受冷冻时长、冷冻-解冻循环次数、HA的分子量及加入的小分子（如二元羧酸和多元醇）的影响。冷冻时间长、冷冻-解冻循环次数多、HA分子量高、二元羧酸（如琥珀酸或戊二酸）的加入使冷冻凝胶的机械强度得到提高，而多元醇（如乙二醇、丁二醇或甘油）的加入则抑制了凝胶化过程的进行。物理交联的存在使冷冻凝胶具有一定的热稳定性、耐酸解和酶解能力，这些都是生物材料的重要性质。此外，本研究还发现：-COOH间的氢键作用提高了HA酸性冷冻凝胶网络分子间相互作用的稳定性，而-COO-与-NHCOCH3基团间的氢键作用则有效提高了中性冷冻凝胶网络的稳定性；然而，羟基对酸性和中性冷冻凝胶中的凝胶网络中的氢键形成均无显著贡献。

文献链接：Freeze−Thaw-Induced Gelation of Hyaluronan: Physical Cryostructuration Correlated with Intermolecular Associations and Molecular Conformation
（Macromolecules, 2017, DOI:10.1021/acs.macromol.7b01264）

【课题组介绍】

近年来，张洪斌课题组在多糖特别是透明质酸研究中发表了一系列文章，内容涉及透明质酸分子表征、溶液和凝胶流变学、粘弹性、药物载体、纳米杂化材料、复合凝胶以及在医药和食品领域的应用。相关论文如下：

[1] Z. X. Cai, H. B. Zhang, Y. Wei, F. S. Cong,Biomacromolecules2017, 18, 1677.

[2] Z. X. Cai, H. B. Zhang, Y. Wei, Y. Y. Wei, Y. N. Xie, F. S. Cong,Biomacromolecules2017, 18, 2102.

[3] F. Zhang, T. Luan, D. Kang, Q. W. Jin, H. B. Zhang, M. P. Yadav,Food Hydrocolloids2015, 43, 218.

[4] F. Y. Yu, F. Zhang, T. Luan, Z. N. Zhang, H. B. Zhang,Polymer2014, 55, 295.

[5] H. B. Zhang, F. Zhang, J. Wu,React. Funct. Polym.2013, 73, 923.

[6] F. Zhang, J. Wu, D. Kang, H. B. Zhang,J. Biomat. Sci-Polym. E.2013, 24, 1410.

[7] Zhang, X. J. Chen, R. A. Boulos, F. M. Yasin, H. B. Lu, C. L. Raston, H. B. Zhang,Chem. Commun.2013, 49: 4845.

[8] F. Zhang, F. M. Yasin, X. J. Chen, J. X. Mo, C. L. Raston, H. B. Zhang,RSC Adv.2013, 3, 25166.

[9] T. Luan, L. J. Wu, H. B. Zhang, Y. Wang,Carbohyd. Polym.2012, 87, 2076.

[10] F. Zhang, J. Wu, H. B. Zhang,J. Solid State Elect.2012, 16, 1683.

[11] T. Luan, Y. P. Fang, S. Assaf, G. O. Phillips, H. B. Zhang,Polymer2011, 52, 5648.

本文由材料人编辑部高分子材料组arrinal_Ding供稿，欧洲足球赛事 编辑整理，点我加入材料人编辑部。

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