Science：景观分析高效筛选PET水解酶

景行 4天前 189浏览

一、【科学背景】 

聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种广泛使用的塑料材料，因其耐久性和广泛的应用而难以自然降解，导致严重的环境污染问题。近年来，科学家们致力于开发能够有效降解PET的酶，即PET水解酶（PETases），以实现塑料的生物回收利用。

尽管已有一些PET降解酶被发现，例如来自细菌Ideonella sakaiensis的IsPETase酶和叶堆肥角质酶（LCC），但这些酶的降解效率和工业应用潜力仍有限。此外，自然界中可能存在更多具有PET降解能力的酶，但目前缺乏有效的方法来识别和评估这些酶的潜力。因此，本文旨在通过一种新的方法——景观分析框架，来系统地评估和筛选具有PET降解能力的酶，以期发现更高效、更具工业应用潜力的PET降解酶。

二、【创新成果】

近日，韩国研究人员开发了一种基于自然序列聚类框架的景观分析方法，用于评估和筛选具有PET降解能力的酶。该方法通过构建一个包含170个聚类和1894个节点的语义网络，涵盖了已知的大多数PETases。通过两轮筛选，研究者发现了三个具有高PET降解潜力的酶系谱（C3、C25和C158），并从中识别出两种具有高活性的PET降解酶：Mipa-P和Kubu-P。这些酶在PET分解速度和耐久性方面表现出色。研究者对Mipa-P和Kubu-P进行了理性工程改造，生成了Mipa-PM19和Kubu-PM12变体。特别是Kubu-PM12，在高底物负荷和工业条件下的PET降解性能超过了现有的工程基准酶。

图1 PETase候选物的景观分析和分析程序。使用指定搜索范围内的种子序列准备酯基塑料水解酶（EPH）库。景观方法如下进行：成对距离计算、邻域分析和布局。分别使用分层和聚类抽样在图上进行初筛和复筛，以追踪该蛋白家族的适应度景观。TPA，对苯二甲酸；MHET，单(2-羟乙基)对苯二甲酸；BHET，双(2-羟乙基)对苯二甲酸。© 2025 Science

本文采用了一种基于自然序列聚类框架的景观分析方法来评估和筛选具有PET降解能力的酶。首先，研究者从GenBank数据库中检索了25,418个非冗余序列，通过PSI-BLAST搜索使用种子序列构建初始序列库。接着，利用Wilbur和Lipman的距离矩阵方法进行成对距离计算，并通过邻域分析模块控制网络的严格性，生成一个包含170个聚类和1894个节点的语义网络。然后，使用Cytoscape软件的Prefuse force-directed-cl布局算法将序列映射到二维拓扑结构中，以便全面展示序列之间的关系。最后，通过分层抽样和聚类抽样方法，从构建的景观中选择代表性节点进行实验验证，以评估其PET降解活性和热稳定性。这种方法为系统评估大量酶的适应度提供了有效的工具和框架，有助于发现和工程化具有工业应用潜力的PET降解酶。

图2 PETase候选物的景观分析。每个节点代表一个特定的天然序列（节点总数为1894）。根据在30°C下平均PET降解活性对测试节点进行着色，边缘以浅灰色显示。三个未探索的聚类用绿色旗帜突出显示，两个强效PETases Mipa-P和Kubu-P用箭头指示并用节点编号标记。基准节点用箭头指示并相应标记。© 2025 Science

图3 PETase筛选。(A) 使用分层抽样进行PETase初筛。从PET释放可检测单体的节点和活性可忽略的节点分别用灰色和黑色圆圈表示。活动数据的标准差（SD）以条形图表示。熔点（Tm）值用圆圈表示，与相应的Boltzmann Tm值用条形图连接表示。IsPETase、LCC和三个未探索聚类中的节点按图中所示的颜色方案着色。(B) 使用聚类抽样进行PETase复筛。C3、C25和C158中的节点在活性-Tm图上显示。八个合格节点被标记，初筛中的代表性节点通过标记形状和在标签中添加星号来区分。阴影代表节点之间的边缘连接。IsPETase和LCC之间的连接线用虚线表示。(C) 三个未探索聚类的网络。图的绘制方式与图2相同。合格节点用实线箭头指示，初筛中未被选为合格的节点用虚线箭头指示。© 2025 Science

图4 Mipa-P和Kubu-P与基准物的比较。(A) Mipa-P和Kubu-P的初始速率和降解程度与基准物进行比较。在30°至70°C的温度范围内测量酶的时间过程活性。初始速率对应于3小时的表观速率，并用灰色虚线及其值表示。从非线性拟合使用四点逻辑模型导出的1小时初始速率值也在括号中标记（星号表示非加权拟合，因为加权模型未收敛）。 (B) 酶的初始速率（3小时）和降解（Depol。）程度（168小时）沿温度变化。酶的初始速率和降解程度排名沿温度变化的雷达图也显示出来。从1到5的排名用指向中心的轴表示。© 2025 Science

图5 Mipa-PM19和Kubu-PM12的性能。(A) Mipa-PM19和Kubu-PM12的晶体结构。结构以灰色卡通模型显示，催化三联体用黄色球体模型突出显示。相对于起始蛋白序列的突变用洋红色棒模型区分并标记。(B) Mipa-PM19和Kubu-PM12与其野生型对照物的比较。链接圆圈或交叉图表示通过单体释放（HPLC采样）或酯键断裂（NaOH消耗）计算的降解程度。(C和D) 酶在高底物负荷条件下的降解性能。以20%（C）和30%（D）的PET负荷进行的生物反应器操作如图5B所示绘制。每个反应的最终重量损失也以白色圆圈显示。© 2025 Science

Mipa-P和Kubu-P是两种具有PET水解活性的酶，分别来源于Micromonospora pattaloongensis和Kutzneria buriramensis。通过对这两种酶进行理性设计和突变工程，研究人员开发出了Mipa-PM19和Kubu-PM12这两个变体。Mipa-PM19和Kubu-PM12在热稳定性方面显著提高，Mipa-PM19的熔点（Tm）达到了92.4°C，比野生型提高了24.1°C，而Kubu-PM12的Tm甚至超过了99.9°C，无法在常规温度范围内测量。此外，这两种变体在PET水解速率和程度上也表现出色，特别是在高温条件下，Mipa-PM19和Kubu-PM12的初始水解速率和最终水解程度都高于其野生型版本。在工业相关的高底物负荷条件下，Kubu-PM12表现出卓越的性能，能够在70°C下快速水解PET。

图6使用KubuPM12进行酶催化PET乙二醇解。(A) 酶催化乙二醇解和在脱酰化步骤的反应机制的示意图。在乙二醇（EG）溶剂下，PET和EG都可以作为酶的变性剂和底物。(B) 通过在EG中预孵育对三种酶的酶催化PET乙二醇解活性和失活模式进行比较。1天反应后BHET、单(2-羟乙基)对苯二甲酸（MHET）和可忽略的对苯二甲酸（TPA）的摩尔分数以甜甜圈图显示。(C) 在生物反应器规模上使用Mipa-PM19和Kubu-PM12进行酶催化PET乙二醇解。温度条件如（B）中标记。© 2025 Science

该研究筛选出两种具有高活性的PET降解酶：Mipa-P和Kubu-P，对Mipa-P和Kubu-P进行了理性工程改造，生成了Mipa-PM19和Kubu-PM12变体，Kubu-PM12在工业条件下的表现尤为突出，能够在高底物负荷和乙二醇作为溶剂的条件下进行PET的酶催化水解，生成双(2-羟乙基)对苯二甲酸酯（BHET）作为主要产物，浓度可达数十毫摩尔。以“Landscape profiling of PET depolymerases using a natural sequence cluster framework”为题发表在国际顶级期刊Science上，引起了相关领域研究人员热议。

三、【科学启迪】

综上所述，本文通过开发一种基于自然序列聚类框架的景观分析方法，系统地评估和筛选了具有聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）降解能力的酶。研究者构建了一个包含170个聚类和1894个节点的语义网络，涵盖了已知的大多数PET降解酶。通过两轮筛选，发现了三个具有高PET降解潜力的酶系谱（C3、C25和C158），并从中识别出两种具有高活性的PET降解酶：Mipa-P和Kubu-P。进一步的理性工程改造生成了Mipa-PM19和Kubu-PM12变体，其中Kubu-PM12在高底物负荷和工业条件下的PET降解性能超过了现有的工程基准酶。这些发现不仅为PET的生物降解提供了新的酶资源，还为工业应用中PET的回收利用提供了潜在的技术支持。

 

原文详情：Seo, H., Hong, H., Park, J., Lee, S. H., Ki, D., Ryu, A., Sagong, H.-Y., & Kim, K.-J. (2025). Landscape profiling of PET depolymerases using a natural sequence cluster framework. Science, 387(6701), eadp5637. https://doi.org/10.1126/science.adp5637

 

本文由景行撰稿

 

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