南京工业大学何冰芳教授和高兵兵副教授团队最新CEJ：3D打印β-半乳糖苷酶流动反应器实现高效低乳糖和无乳糖牛奶的生产

牛奶含有人体必需的微量营养素，对人们平衡膳食至关重要。然而，乳糖不耐症患者在摄入含有乳糖的牛奶后，由于肠道中缺乏水解乳糖的乳糖酶，会出现腹胀、腹泻和肠胃痉挛。尽管现在食品工业通过膜分离、超滤和添加游离β-半乳糖苷酶等方法实现了低乳糖和无乳糖牛奶的生产，然而生产工艺复杂和生产过程中资源浪费导致其低成本效益。其中β-半乳糖苷酶将乳糖分水解为葡萄糖和半乳糖，高效水解牛奶乳糖的同时不影响牛奶的营养价值。因此，一种高效，操作稳定和安全的 β-半乳糖苷酶固定化方法用于低乳糖和无乳糖牛奶的生产具有重要意义。

为了实现这一目标，南京工业大学何冰芳教授团队开发出一种3D打印β-半乳糖苷酶流动反应器用于低乳糖和无乳糖牛奶的生产（图1）。通过聚乙烯亚胺和透明质酸钠层的层层自组装快速修饰3D打印聚乳酸支架简化酶固定化载体修饰过程，京尼平作为交联剂共价固定了β-Gal保证高效、稳定地固定酶（固定效率为 92.87%）。此外，集成到流动反应器中的3D打印支架通过定向通道扰动了不同反应器中的流体，改善了内部传质，从而实现了高催化活性（乳糖水解效率为 94.20%）。在β-Gal流动反应器中反应 6 小时和 12 小时的牛奶乳糖残留量分别为 1.87 g dL^-1和 0.38 g dL^-1，完全符合食品安全国家标准对低乳糖和无乳糖牛奶的要求。该反应器酶固定化效率高，催化活性稳定，在低乳糖和无乳糖牛奶生产及其他生物催化领域具有广阔的应用前景。

图1 用于高效低乳糖和无乳糖牛奶生产的3D打印β-半乳糖苷酶流动反应器

在本研究中，研究人员制作内部具有定向通道和孔隙的3D打印聚乳酸支架（图2）。与传统的酶固定化载体如微纳米粒子、水凝胶等相比，3D打印支架可以更简便的和流动反应器相结合而不用考虑管道堵塞和压实的问题。此外，聚乙烯亚胺和透明质酸钠层层自组装修饰3D打印支架简化酶固定化载体修饰过程。

图2 3D聚乳酸支架以及聚乙烯亚胺和透明质酸钠层层自组装修饰过程

此外，京尼平作为一种交联剂，目前已被广泛研究用于高效共价连接酶分子和改性载体支架，更重要的是，它的细胞毒性比传统交联剂戊二醛低 5,000-10,000 倍。在酸性条件下，β-半乳糖苷酶的伯氨基进攻京尼平的 C3，打开二氢吡喃环，形成芳香族氨基。研究人员通过条件优化实现了β-半乳糖苷酶的高效固定和稳定的固定化酶性质（图3）。

图3 固定化条件优化和固定化酶学性质研究

同时，研究人员将3D打印β-半乳糖苷酶支架和流动反应器相结合，通过设计不同的支架内部结构研究流体扰动对于酶和底物传质影响。此外，还通过COMSOL模拟进一步研究流体在反应器内部分布。集成到流动反应器中的3D打印支架通过定向通道扰动了不同反应器中的流体，改善了内部传质，从而实现了高催化活性（牛奶乳糖水解效率为 94.20%）（图4）。

图4 3D打印β-半乳糖苷酶流动反应器的乳糖水解性能

以上成果以题目“Sustainable 3D-printed β-galactosidase Immobilization Coupled with Continuous-flow Reactor for Efficient Lactose-free Milk Production”发表在国际顶级期刊Chemical Engineering Journal杂志上（影响因子15.1）（论文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.148557）。论文第一作者为南京工业大学药学院硕士研究生邵云，通讯作者为南京工业大学药学院的何冰芳教授以及高兵兵副教授。研究工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、江苏省自然科学基金等项目的资助。