清北联合Nature Commun.：新型功能化石墨烯改善冷冻电镜优势取向

一、【导读】

2017年诺贝尔化学奖授予Jacques Dubochet, Joachim Frank 和Richard Henderson，以表彰他们对“冷冻电镜技术”领域的贡献，该奖被戏称为“一个发给了物理学家的诺贝尔化学奖，奖励他们帮助了生物学家”。早在20世纪70年代科学家们就利用冷冻电镜（Cryo-EM）研究病毒分子的结构，首次提出了冷冻电镜技术的原理、方法以及流程的概念。单颗粒Cryo-EM三维重构技术是目前用于解析生物大分子高分辨率结构的主流手段之一。然而，高质量的Cryo-EM样品制备仍然面临很多挑战，如气液界面、优势取向和背景噪音等，极大地限制了结构解析效率。

二、【成果掠影】

近日，清华大学王宏伟教授、饶燏教授、刘楠博士和北京大学彭海琳教授等人合作在知名期刊Nature Communications上以题为“Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM”报告通过重氮盐分子对CVD生长的石墨烯膜进行功能化修饰开发了具有不同电荷性质基团的功能化石墨烯支撑膜，用于Cryo-EM样品制备。与聚合物转移法相比，石墨烯支撑膜以石蜡作为转移介质可以洁净地转移到电镜载网上，其污染更少。通过应用于三种不同类型的生物大分子，证明了高产率功能化石墨烯电镜载网可使大分子远离气液界面（AWI），并实现了可调节的粒子取向分布，以实现更稳健的单颗粒冷冻电镜结构测定。研究表明，这种功能化石墨烯支撑膜提供了一种较为友好的作用界面，有助于保护生物大分子的三维结构。清华大学生命科学学院博士生陆叶、博士后刘楠，药学院博士生刘永波以及北京大学化学与分子工程学院博士毕业生郑黎明为本文共同第一作者。

三、【核心创新点】

开发了具有不同电荷基团的功能化石墨烯支撑膜，用于Cryo-EM样品制备，可使生物大分子远离AWI，并实现了可调节的粒子取向分布，以实现更稳健的单颗粒冷冻电镜结构测定。

四、【论文掠影】

图1、石蜡辅助石墨烯在EM支撑膜上转移©2022 Hongwei Wang

（a）石蜡辅助的石墨烯转移到EM支撑膜上的示意图。

（b）石蜡转移的石墨烯支撑膜的高倍率TEM图像。

（c）高倍率的AFM图像。

图二、功能化石墨烯支撑膜的表征©2022 Hongwei Wang

（a）用于冷冻电镜分析的功能化石墨烯的示意图。

（b）悬浮功能化石墨烯膜的代表性TEM显微照片。

（c）石墨烯（红色）和功能化石墨烯（蓝色）的拉曼光谱。

（d）石墨烯（红色）和官能化石墨烯（蓝色）的积分布拉格反射相对强度。

（e）NFG和SFG的X射线光电子光谱。

（f）石墨烯、NFG和SFG的水接触角（WAC）。

图三、不同电性修饰的石墨烯用于Cryo-EM分析©2022 Hongwei Wang

（a）cryo-ET重建揭示了20S蛋白酶体在NFG膜上的分布。

（b）从NFG支撑的样品的低温层析图中提取的石墨烯表面剖面。

（c）20S蛋白酶体在NFG上的欧拉角分布。

（d）cryo-ET重建显示20S蛋白酶体在SFG膜上的分布。

（e）从SFG支撑的样品的低温层析图中提取的石墨烯表面剖面。

（f）20S蛋白酶体在SFG上的欧拉角分布。

（g）50S核糖体在NFG上的欧拉角分布。

（h）50S核糖体在NFG上的首选视图。

（i）50S核糖体在SFG上的欧拉角分布。

（j）50S核糖体在SFG上的首选视图。

图四、具有不同电荷的石墨烯解决L1 LtrB RNP的优先取向问题©2022 Hongwei Wang

（a-d）L1.LtrB RNP复合物在NFG和SFG上的颗粒取向分布。

（e）使用NFG和SFG的组合颗粒重建的L1.LtrB RNP复合物的三维重构密度图。

（f）L1.LtrB RNP的DV密度与相应的模型对接（PDB: 8H2H）。

五、【前景展望】

综上所述，研究人员开发了一种有效的清洁转移策略，使用石蜡作为转移媒介来制造带电的石墨烯膜，然后通过重氮盐分子对CVD生长的石墨烯膜进行功能化修饰。带电的石墨烯支撑膜根据目标分子的表面电荷特性，为蛋白质分子或大分子复合物提供了不同性质的表面，以便与之相互作用。因此能够调控取向分布，避免了AWI带来的负面影响，成功解决了优势取向问题。

文献链接：Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM(Nat. Commun.,2022,13, 6718)