复旦大学Nature子刊：4分钟即可出核酸结果

引言

因为许多与疾病相关的生物标志物的丰度极低，所以对生物溶液中痕量分析物进行超精确分析对于生物研究、精准医学和早期诊断具有重要意义。这种精确的分析接近生物传感器的极限，不可避免地会受到大量非特异性蛋白质、核酸或其他背景生物分子的影响。目前，一些技术可以通过使用纳米尺度的传感器，利用微小的测试体积和超小的识别截面来实现单个或少数分子的检测，但它们在宏观溶液缺乏分子水平的灵敏度。尽管在过去几十年时间中科研人员做出了大量的努力，但是超精准的生物检测仍然是化学和生物科学中的一个关键问题。特别是在2019冠状病毒病(COVID-19)大流行和其他大规模流行病的背景下，超精准的生物检测尤为重要。由于在待测溶液中检测超低浓度的目标分子存在挑战性，目前还没有将直接的SARS-CoV-2核酸检测方法应用于COVID-19的临床诊断。目前已经建立的方法，即基于定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)的技术，这种技术的灵敏度有限，而且需要核酸提取和扩增程序，需要熟练的技术人员、特定的实验室和设备，处理时间较长(>2h)；因此，现场和即时检测SARS-CoV-2核酸仍然是一个障碍。尽管目标扩增大于10⁶倍，qRT-PCR检测极限(limit of detection, LoD)通常是每微升约0.2-1拷贝(~0.3 × 10⁻¹⁸~ 1.7 × 10⁻¹⁸M)。简单、快速和超精确的核酸检测方法将有助于减缓SARS-CoV-2的快速传播。

微机电系统(Microelectromechanical systems, MEMS)是一种典型的集成度高、体积小、成本低、效率高、具有商业化可行性的系统。MEMS集成了微米级的机械元件，结合微电子学知识，将机械、化学、生物或其他传感响应转换为电信号。通过与场效应晶体管(field-effect transistors, FETs)的集成，MEMS可以制造超灵敏的生物传感器，因为FETs将高效的传感器与信号放大器结合在一起，其中一个小的参数变化就会引起通道电流的显著变化。由于更小的尺寸，可使检测具有更高的灵敏度和分辨率，通过将特征尺寸小型化到亚微米尺度，纳米机电系统(nanoelectromechanical systems, NEMS)在提高传感性能的同时降低了成本、体积、重量和功耗。然而，这些系统的性能仍然远远低于许多生物系统，在生物系统中，生物识别和反应通常通过精确的分子水平机制发生。

对于基于MEMS、NEMS和FETs的生物传感器，如果不设计传感界面和在分子水平上操纵系统，在缓冲液或稀释的生物液中灵敏度很少能达到10^-17M(100微升中约600拷贝)。如果在复杂和高离子强度的生物液体中更难达到这种灵敏度。近年来，一些依赖于化学结合诱导几何变化的分子尺度系统已被开发用于化学传感。但其检测灵敏度一般在10^-14~10^-6M。

研究进展

近日，来自复旦大学魏大程团队与朱召芹（共同通讯作者）合作在Nat Biomed Eng上发表文章，题为“Rapid and ultrasensitive electromechanical detection of ions, biomolecules and SARS-CoV-2 RNA in unamplified samples”。 魏大程团队报道了一个分子系统用于生物液体中未扩增的金属离子(Hg²⁺)、蛋白质(Thrombin)、生物小分子(ATP)以及新冠病毒核酸(RNA和cDNA)的快速和超灵敏的机电检测(在100微升中可检测到1到2拷贝)。此外，该团队将用于检测SARS-CoV-2的机电生物传感器集成到一个便携式原型设备中，并表明它在4分钟内即可检测到SARS-CoV-2 RNA的信号响应，无需提取RNA或核酸扩增。

图文介绍

图1. MolEMS和MolEMS g-FET©2022 Springer Nature

a. MEMS或NEMS生物检测原理图

b. MolEMS及其静电驱动原理图

c. MolEMS g-FET的器件装置图

d, e. 该装置的照片(d)和光学显微镜图像(e)

f. 石墨烯与MolEMSs修饰后的AFM图像

g-i. 用Cy3-17bp-15T MolEMSs修饰的石墨烯的荧光强度图像，V_lg为0.9V(g)、0V(h)和−1.1V(i)

图2. 超灵敏的生物检测和长期稳定性©2022 Springer Nature

a-c. 在V_lg=−0.5V(a,c)， 0V(b,c)和0.5V(b,c)时，TBA功能化MolEMS修饰的g-FET在1× TRB缓冲液中添加凝血酶(从5 × 10⁻¹⁸M到5 × 10⁻¹⁰M)的实时∆I_ds响应(a,b)和∆I_ds响应(c)

d. MolEMS的传感机理

e. 在全血清中(黑色、绿色)和在1× TRB缓冲液中依次加入凝血酶(红色)或全血清中(蓝色)，TBA功能化MolEMS修饰的g-FET装置的∆I_ds/I_ds0与t的关系曲线

图3.通用性、特异性性和探针结构设计©2022 Springer Nature

a, b. 不同浓度的ATP (1× AM)、Hg²⁺(1× TM)、ATP(全血清)和ss-DNA-T(全血清)在MolEMS与相应探针静电作用下的|∆I_ds/I_ds0| (a)和实时∆I_ds/I_ds0(b)响应

c. MolEMS g- FETs对添加目标分析物(5 × 10⁻¹⁶M)和非目标分析物(5 × 10⁻¹⁵M)的|∆I_ds/I_ds0|响应

d. 四种DNA结构示意图

e. 当使用不同的DNA结构(V_ds= 50mV)时，dirac点位移作为凝血酶浓度的函数变化量

图4. SARS-CoV-2核酸检测©2022 Springer Nature

a. 采用qRT-PCR和MolEMS g- FETs技术检测SARS-CoV-2核酸的工作流程

b. 基因组图谱显示探针和样品1-5所用的选定序列(及其相对位置)。

c. 在全人工唾液中加入样本1和样本2(从0.1到500拷贝/微升)(技术样本)后的|∆I_ds/I_ds0|响应

d. 添加F1, 6% P1和100% P1(生物样本)的∆I_ds/I_ds0与t的关系曲线

e. 对应于每个临床样本的|∆I_ds/I_ds0|响应

f. 在VTM中稀释P32浓度从0.01拷贝/微升到100% P32(生物样本)的∆I_ds/I_ds0与t的关系曲线

g. 在VTM中稀释的P27-P33 (生物样本)的|∆I_ds/I_ds0|响应和Ct值

h. MolEMS(本工作)与采用qRT-PCR、US CDC或中国NMPA批准的qRT-PCR、RT-LAMP、CRISPR、RPA、SPR和EC检测SARS-CoV-2核酸检测的比较

小结

与MEMS和NEMS相比，MolEMS降低了成本、体积和重量，并实现了分子水平的调控。在静电驱动下，MolEMS允许在高离子强度缓冲液或生物液中对蛋白质、小分子、离子和核酸进行特异性检测，甚至在连续暴露于全血清15天后也可以进行5×10^-20M的检测。MolEMS是一种超灵敏的生物传感器，且具有优异的防污性、检测选择性、稳定性和通用性。MolEMS g-FETs可以直接检测在鼻咽拭子样本中未扩增的SARS-CoV-2核酸，且检测浓度低至每微升约0.02拷贝。该设备实现了快速和无标签检测，并易于操作。特别是在临床样本中，MolEMS检测COVID-19的时间约为0.1-4 分钟(比qRT-PCR快)，无需RNA提取和扩增过程。结合便携式系统可以在机场、诊所和当地急诊科，甚至在家里进行现场和即时检测。除了COVID-19, MolEMS的开发还可以在几分钟内对其他疾病进行超精确诊断，而不需要通常需要数小时或数天的目标纯化、扩增或培养过程。此外，MolEMS的设计原则可以用于生物传感之外的其他机电设备和功能系统的设计，具有更高的精度。

文献链接：Rapid and ultrasensitive electromechanical detection of ions, biomolecules and SARS-CoV-2 RNA in unamplified samples. 2022,Nature Biomedical Engineering, DOI: 10.1038/s41551-021-00833-7.

本文由纳米小白供稿

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