Adv. Mater.综述：用于分子相互作用的功能化肽-金杂化纳米材料的合理设计

【背景介绍】31

金纳米粒子（AuNPs）由于其优异的光学性质，在生物传感相关的发展中得到了广泛的应用。肽作为一种新型的功能性生物分子，有望取代抗体、受体和底物进行特定的分子相互作用。肽和AuNPs都是稳定的，并且容易合成，制备成本都相对较低。因此，基于肽AuNPs的生物纳米技术越来越受到人们的关注，特别是在分子靶向、细胞成像、药物传递和治疗等领域。

【成果简介】

最近，奥地利国家技术研究院Wolfgang Knoll教授、新加坡南洋理工大学Bo Liedberg教授和温州医科大学王毅研究员综述了近年来关于功能化肽-金杂化纳米材料的最新研究进展。以“Rational Design of Functional Peptide-Gold Hybrid Nanomaterials for Molecular Interactions”发表于Adv. Mater.期刊上。在本文中，作者从肽功能化的角度对肽-金（主要是AuNPs）杂化纳米材料进行研究，并讨论了其包括生物传感、细胞靶向、成像以及抗菌防污涂层的开发等生物方面的应用。作者介绍了过去25年来肽-金杂化纳米材料应用的发展，从著名的DNA-AuNPs组装，到分子识别和组装的肽-AuNPs被深入研究并应用于各个生物医学领域，如体外酶分析、细胞靶向相关分析如细胞成像、细胞结合、穿透和核靶向、脑-血屏障（BBB）易位和癌症治疗等。作者还介绍了最近的肽-AuNPs的新功能/应用，如催化剂、抗菌剂、辅助多光子显微镜和手性AuNPs结构的形成等等，并为这一研究课题提供了新的方向。

【图文解读】

1、引言

图一、这篇综述的结构示意图

图二、在过去25年中，肽-金纳米粒子在开发应用方面的重要历程

2、相互作用的肽与AuNP结合物

2.1、功能化合成肽

图三

（A）从噬菌体库（噬菌体表面不同颜色的多肽）开始噬菌体展示示意图。接下来的肽选择是通过结合（蓝色）、洗脱（蓝色和非特异性橙色）和扩增的循环来完成的。非特异性肽（橙色）被多重选择循环边缘化；

（B）上部：肽设计，结合位点有一个连续序列（粉红色）作为表位。下：肽设计，三个肽段（黄色、绿色和红色）位于结合袋中，由分子支架连接，以模拟天然蛋白质的三维结构；

（C）单壁碳纳米管（SWNT）结合肽结构预测的分子动力学模拟。

2.2、多肽对AuNPs的稳定作用

图四

（A）与其他两种肽相比，固定化后具有特殊稳定性的保护性五肽（CALNN）的选择性；

（B）互补肽折叠诱导的AuNP聚集：异源二聚；

（C）AuNP聚集诱导的肽折叠：同源二聚；

（D）功能化AuNP作为模板将合成肽折叠成α螺旋结构。

2.3、肽-AuNP结合物的受控相互作用

3、基于肽-金杂化纳米材料的靶向分子

3.1、肽-金底物用于酶分析

3.1.1、水解反应

图五

（A）利用设计的肽和AuNPs比色蛋白酶传感过程示意图；

（B）用设计的His₆末端肽和金属离子进行蛋白酶羧保护AuNP比色分析示意图；

（C）培养60分钟后，在存在或不存在镍离子的情况下，含有不同肽的溶液中的羧基AuNP照片（1:AuNP，2:AuNP/His₆-pep，3:AuNP/His₆-pep/Ni²⁺，4:AuNP/His₆-pep-His₆，5:AuNP/His₆-pep-His₆/Ni²⁺）；

（D）通过蛋白水解去除末端疏水基团，蛋白酶可裂解的Fmoc剩余肽修饰聚合的AuNPs，其再分散的示意图和相应的TEM图像；

（E）设计的肽结构:1、完整的热溶酶肽底物，2、裂解后；

（F）添加酶前（实线）和酶孵育6小时后1-AuNPs的紫外-可见光谱（虚线）；

（G）250和45 ng·mL⁻¹热溶酶肽在5分钟间隔内的预聚集1-AUNP（用Δ比率A/D表示）的再分散水平。

图六

（A）MMP-7在AuNPs上裂解底物肽诱导的聚集过程示意图；

（B）用MMP-7蛋白酶消化前（+，黑色）和消化后（+，红色），金表面图案肽底物的椭圆偏振对比图像，具有相应的高度分布；

（C）使用两种肽设计（1和2）和生物功能化AuNPs进行BoLcA检测的混合和桥接分析；

（D，E）用100 nM的BoLcA D）和预孵育（作为对照）E）后的navi-AuNPs和1-AuNPs混合物溶液的归一化消光光谱。插图是显示颜色变化的相应AuNP溶液的照片。

图七

（A）荧光染料标记肽底物和表面反应性AuNPs组成了荧光染料荧光探针的总体方案；

（B）肽功能化AuNP和链霉亲和素之间能量转移的示意图-alex488（SA488）在BoLcA催化裂解之前（猝灭）和之后（恢复）；

（C）用不同浓度的BoLcA（1 pM，10 pM，100 pM，1 nM，3 nM，10 nM）和胰蛋白酶（10 pM和1 nM）预处理的1.4 nM AuNP-pep上，SA488的荧光强度随时间而变化；

（D）(C)中2小时反应时间对应的BoLcA检测校准曲线；

（E）用AuNP肽QD结合物检测蛋白酶原理及抑制剂筛选示意图；

（F）用蛋白酶特异性肽底物与AuNPs结合的各种量子点，在玻璃上显示其相应的颜色（绿色：MMP-7，红色：caspase-3，橙色：凝血酶）的复合蛋白酶分析示意图。

图八

（A）以中性亲和素包被的AuNP为核心，生物素化肽AuNP作为卫星组成的冠纳米颗粒探针示意图；

（B）caspase-3介导的冠纳米颗粒探针裂解示意图；

（C，D）Caspase-3裂解导致冠纳米颗粒探针的分解过程，如C）散射图像：红色到黄色到暗绿色斑点，以及D）光谱：最初从654 nm（红色）蓝移；

（E）逐级强度下降表明单卫星纳米颗粒分裂；

（F）在显微镜图像中，明亮的和红色的斑点显示细胞将冠状纳米颗粒探针通过细胞穿透肽(Thr-Ala-Thr)递送到HeLa和SW620；

（G）在加入凋亡诱导剂（TNF-α和CHX）后，细胞内的Caspase-3活性逐渐变为暗红色/绿色，而在没有凋亡诱导剂或添加Caspase-3抑制剂（z-DEVD-fmk）的细胞中，没有观察到信号变化。

图九

（A）基于设计的肽底物和AuNPs的比色法ALP分析示意图，其中肽中磷酸酪氨酸的负电荷阻止AuNP聚集，直到ALP去除肽上的磷酸基团，导致肽桥接AuNP聚集，然后变色；

（B）碱性磷酸酶的比色分析显示，随着时间的推移，颜色以剂量依赖的速率逐渐变化；

（C）通过比较650 nm处的吸收强度与碱性磷酸酶抑制剂（p-BO）浓度，得到了基于相同比色系统的碱性磷酸酶抑制试验的动力学曲线；

（D）基于磷酸化二肽存在下合成AuNPs的比色ALP分析示意图；

（E）照片显示了在ALP预处理存在(+)和不存在(−)情况下，与一系列肽浓度合成的AuNPs的颜色差异；

（F）基于设计的生物素化二甲基化肽底物和抗二甲基抗体的亲和素包被AuNPs的比色LSD1分析示意图。

3.1.2、磷酸化反应

图十

（A）生物素化与经激酶修饰的底物肽磷酸化配对的示意图，在添加亲和素包被的AuNPs后导致随后的聚集（颜色变化），而在存在激酶抑制剂的情况下，未观察到聚集（红色残留）；

（B）基于AuNP聚集的比色激酶活性测定：带正电的肽底物在没有激酶的情况下诱导AuNP聚集（颜色变化），而PKA激酶反应后，由于正电荷丢失，肽不再诱导AuNP聚集；

（C）抑制剂H-89对PKA活性的抑制作用；

（D）基于设计的肽功能化AuNPs和抗磷酸盐抗体AuNPs的比色激酶分析示意图：由激酶导致AuNP混合物聚集的肽磷酸化；

（E）在不存在激酶（折线）和v-Src-激酶（实线）的情况下混合AuNPs溶液的紫外-可见光谱。插图：显示相应AuNPs溶液的TEM图像。

图十一

（A）基于RLS的PKA及其抑制分析示意图：在PKA存在下，设计肽底物的生物素化和磷酸化导致亲和素涂层的AuNPs附着，然后银沉积以增强RLS信号；

（B）基于设计的肽模板金纳米团簇的荧光PTM酶分析示意图。PTM修饰的肽底物使荧光共轭纳米材料猝灭；

（C）随着HDAC-1浓度的增加，荧光发射光谱逐渐下降；

（D）利用设计的肽功能化AuNPs进行基于表面电荷检测的激酶活性测定示意图；

（E）AuNPs和AbI1激酶浓度的表面zeta电位校准曲线；

（F）飞行时间二次离子质谱显示，激酶反应后肽底物分子量直接增加，相当于HPO₃分子量，伴随着原始信号强度的降低。

3.2、肽结合物用于生物传感和细胞靶向

3.2.1、用于生物传感

图十二

（A）基于所设计的肽结合物功能化AuNPs的蛋白质分析物检测原理示意图。Zn2+离子诱导的肽折叠导致了AuNPs的聚集，而HCAII等蛋白质分析物的结合阻止了肽的折叠和随后的聚集；

（B，C）在不存在B）和存在C）HCAII蛋白质的情况下，添加10 mM Zn²⁺离子后，以2分钟间隔记录20分钟的紫外-可见光谱；

（D）基于肽粘合剂和AuNPs的Ag⁺比色检测示意图。添加Ag⁺后肽键的折叠诱导AuNPs的聚集；

（E）基于肽官能化AuNPs络合比色法检测金属离子示意图；

（F）不同功能性肽对金属离子的比色响应。

图十三

（A）用不同大小和浓度的肽粘合剂功能化AuNPs检测cTnI的示意图。简单加入靶cTnI后，以浓度依赖的方式诱导快速聚集；

（B）针对100 ng mL⁻¹cTnI，绘制了与AUNP不同相对表面积（每种尺寸的四种稀释因子：16 nm，黑色正方形；25 nm，红色圆圈；36 nm，蓝色三角形）的峰值（质心）偏移；

（C）基于肽功能化AuNPs的CB[8]分子存在下比色检测Flt-1的示意图；

（D）含有靶病毒表位、连接子（GGG）和半胱氨酸残基的肽的线性结构；

（E）在相应的肽基表位包被的AuNPs溶液中添加200 nM单克隆抗体后，每隔10分钟记录一次紫外-可见光谱，表明存在大量聚集。

图十四

（A）固定PEG层（黑色）和抗体（绿色）后，裸金（橙色）的代表性LSPR光谱，以及外显体（红色）的最终检测，并附有简单的示意图。扫描电子显微镜（SEM）显示了外显体与金纳米孔的结合；

（B）nPLEX法与ELISA法的敏感性比较，nPLEX法测定不同浓度外显体的结果优于ELISA法；

（C）基于抗菌肽magainin I及其结构（彩色α-螺旋）的细菌电检测示意图，包括在金微电极阵列上的固定和靶菌的结合；

（D）在10赫兹下对不同浓度大肠杆菌进行阻抗测量，估计LOD为103 cfu mL⁻¹（≈1个细菌/μL）；

（E）肽结合物电化学检测诺如病毒的工作流程示意图，包括噬菌体展示技术的肽选择（1）、肽结合物（1-2）的设计和合成、固定化（2-3）和试验（3-4）。

3.2.2、用于细胞靶向和后续应用

图十五

（A）柱状图显示肽5（ConG序列：GEXXLQXNQXLIRXKSNC，X:γ-羧谷氨酸盐，末端C固定化）功能化AuNPs（AuNP-5）与HEK 293细胞表面NMDA受体的选择性结合；

（B）与经AuNP-6处理的细胞（右，几乎找不到）相比，AuNP-5与转染细胞选择性结合的扫描电镜图像（左，许多亮点）；

（C）AuNP-5与转染细胞的结合曲线表明，由于多价性，结合亲和力比游离ConG提高了一千倍；

（D）肽功能化AuNPs选择性靶向细胞整合素GPIIb/iia用于成像（i）和定量比色传感（ii）的示意图；

（E）培养细胞暴露于120 n M肽-AuNPs（第一行）和作为阴性对照的分散介质（第二行）的明场（第一列）和双光子荧光（第二列）图像，表明了这种纳米探针的特异性；

（F）线性拟合曲线将细胞数与AuNPs浓度（红色）和色度信号（蓝色）相关联，从而能够计算出每个细胞表面上整合素GPIIb/iia的数量。

图十六

（A）靶向p32表达MDA-MB-435细胞的天然LyP-1肽的化学结构；

（B）LyP-1肽（紫圈）通过点击化学和靶向表达受体（红色）的azido-PEG包被AuNPs上的功能化示意图；

（C）靶向癌细胞的LyP-1-AuNPs荧光图像（右）显示近红外荧光增强（红色），而叠氮-PEG-AuNPs作为对照（左）则没有观察到可检测的信号；

（D）含BSA蛋白的特异性核靶向肽AuNPs功能化示意图；

（F）pHLIP-EuL-AuNPs易位到细胞的示意图。该机制主要是由于pHLIP-EuL-AuNPs处理的人血小板在较低的pH导致其pHLIP的构象由无规卷曲变为螺旋；

（G，H）未处理G)和经pHLIP-EuL-AuNPs处理H)的人血小板的TEM图像。后者显示纳米颗粒能穿透各种血小板结构，如小泡（v）、开放小管系统（ocs）和细胞质（c）。

图十七

（A）肽的设计和通过内吞小泡从血液到大脑的肽转移示意图。该肽包含识别转铁蛋白受体的THR序列和针对脑内Aβ聚集物的LPFFD序列；

（B）大鼠脑中不同的金含量表明，与其他对照组相比，通过血脑屏障传递的THR-CLPFFD-AuNPs量最高；

（C）用于治疗和诊断目的的TAT-AuNPs注入脑肿瘤的示意图。治疗药物（Dox）通过pH敏感连接物（左上）与TAT-AuNPs连接；MRI造影剂（Gd3+）螯合在TAT-AuNPs上，最终在肿瘤细胞（右上）中积聚；

（D）注射Dox-TAT-AuNPs后，用H&E（组织结构）和银增强（AuNPs）染色的小鼠脑组织的显微图像，显示纳米颗粒在肿瘤上的定位；

（E）颅内肿瘤荷瘤小鼠静脉注射Dox-TAT-AuNPs（red）后的Kaplan-Meier生存曲线与相同剂量Dox的其他对照组比较；

（F）Gd³⁺-TAT-AuNPs注射24小时后荷瘤小鼠的T2加权MRI水平切片（红色虚线圆圈：肿瘤组织）；

（G、H）相同治疗方法的荷瘤小鼠的组织学研究。脑组织经H&E和银增强染色（黑点：增强AuNPs）；

（J）BBB渗透性Angioppe2肽功能化对酸敏感的AuNPs示意图。生理酸性条件下触发PEG层脱膜后，两种纳米粒（叠氮-和炔基-）通过点击化学聚集，最终在脑肿瘤组织中积聚；

（K）在注射混合功能性AuNPs之前、1小时和24小时后，移植瘤小鼠的脑T1加权MRI，显示由于纳米颗粒在胶质瘤边缘积聚，信号增强（黄色箭头）；

（M）注射混合功能AuNPs后24小时胶质瘤脑组织的组织学和拉曼光谱图像：虚线以上区域。

4、肽-金杂化纳米材料的其他应用

4.1、抗菌活性

图十八

（A）万古霉素结合AuNP与VRE菌株之间多价相互作用的示意图；

（B）万古霉素定向合成AuNPs的反应机理；

（C）在不同实验条件下，在CM-SH和CM肽存在下合成AuNPs；

（D）通过碳二亚胺化学将1018K6肽与聚合物AuNPs偶联；

（E）抗菌肽偶联阳离子AuNPs的制备及其与pDNAs和细胞相互作用的示意图。

4.2、防污性能

图十九

（A）包含分子识别部分（RGD，紫色）、超低污染部分（EK repeats，蓝色）和表面锚定部分（PPPPC，绿色）的自组装单分子膜的肽序列；

（B）用表面等离子体共振法（SPR）测试了在防污肽（含有EK重复序列和PPPPC作为连接剂的肽）表面活性剂（SAM）上的蛋白质吸附，纤维蛋白原（黑色）和溶菌酶（白色）的表面活性剂（SAM）与其他两种相比几乎没有附着;

（C）细胞粘附图像显示，随着RGD肽百分比的增加（从0%增加到100%），在肽单层上培养的细胞密度增加；

（D）巯基化两性离子肽在金表面自组装过程示意图；

（E，F）非特异性蛋白质结合在两性肽和两亲/非离子肽上，分别与简单溶液（E）和天然复合溶液（F）结合。两性肽（白色）比两亲性/非离子肽（黑色）具有更好的防污性能；

（G）用His（No:1-3）自组装到带正电荷的AuNPs上的设计肽的示意图，这使得利用底物Cbz-Phe-ONP催化酯交换反应；

（H）由Zn²⁺离子触发的分散和聚集JR2EC AuNPs的示意图（上）及其在多光子激光扫描显微镜中的可视化（下）。

4.3、其他类型的功能肽

5、未来的挑战与机遇

【小结】

综上所述，作者总结了近些年用于分子相互作用的功能化肽-金杂化纳米材料的最新研究进展。作者认为，利用肽-金纳米共轭物对抗新型靶标来实现新的传感/靶向策略是非常具有挑战性的。尽管目前已经开发了许多基于肽-AuNP的分析方法，但大多数方法只与一小部分靶点发生冗余作用。比如大多数酶反应偶联物只针对一些催化反应：蛋白质水解和（de）磷酸化。但随着许多在特定病理过程中起关键作用的其他酶的检测已经利用肽-AuNPs发展起来。作者认为利用特定设计的肽或肽辅助组装手性结构的AuNPs（手性等离子体光子学）检测/筛选手性分子/药物的机会仍然存在。作者指明，具有设计构象的肽可能为手性分子的对映选择性检测或分离提供高亲和力以设计功能肽。此外，可以从这些温和肽中设计出合适的肽阵列，并将其作为一个功能单元来利用，从而模拟传感。而在另一方面，提高肽-AuNPs基传感器的敏感度也是一个极为重要的发展方向。这可以通过改变AuNPs的形状或构建新的纳米组装体以监测周围环境局部折射率的微小变化，以及使用肽-AuNPs的FRET策略、与电化学或者拉曼光谱等组合方法用于提高各种检测的灵敏度。最后，作者认为将功能性肽-AuNP结合物应用于现场试验或临床诊断/成像和治疗是另一个极具挑战性的研究方向。然而，大多数生物传感工作仍然局限于相对清洁的水环境中。这对靶分子具有温和亲和力的肽受体可能适用于需要自发可逆结合的实时临床监测，同时还要有体内毒理性方面影响的考虑。此外，肽-AuNPs的实际应用还需考虑到简单性、成本和生态效率等方面因素。总之，功能性肽金纳米材料已被广泛应用于靶向性应用，作者预计新的肽设计和纳米技术将为未来在生物医学领域和其他领域的应用铺平道路。作者认为，面对高灵敏度和特异性解决真实/临床样本检测的挑战，细胞靶向/成像和医学治疗将是医学、生物工程、表面和材料科学界长期需要解决的问题，而肽-AuNPs则有望为其发展提供一个理想的技术平台。

文献链接：Rational Design of Functional Peptide‐Gold Hybrid Nanomaterials for Molecular Interactions（Adv. Mater.2020, 2000866.）

【王毅教授简介】

温州医科大学眼视光学院、生物医学工程学院教授，中国科学院大学温州研究院研究员，浙江省海外高层次人才计划特聘专家。2010年获德国美因茨大学、德国马普高分子所博士学位。之后在奥地利国家技术研究院、新加坡南洋理工大学从事科研工作。近年来，团队主要在SPR和拉曼传感器的开发、生物和纳米复合材料等生物化学传感器方面开展研究工作，应用于临床肿瘤诊断、神经组织成像等。现主持国家重点研发计划项目（课题）、国家自然科学基金、浙江省杰出青年科学基金等项目。截止目前在Advanced Materials, Chemical Science, Analytical Chemistry, Biosensors and Bioelectronics等期刊发表SCI论文50余篇，H指数26，英文著作3部，申请发明专利15项。

近年来，王毅团队与其合作者利用多肽-金纳米颗粒混合材料在生物传感领域进行了系列的研究，包括：通过自行设计的多肽底物结合金纳米颗粒进行神经毒素的比色法和荧光淬灭法检测（Analytical Chemistry,2014, 86, 2345-2352；Chem Sci,2014, 5, 2651-2656.），总结了由不同形状、大小等金纳米颗粒进行肉眼可识别比色法的规律（Analytical Chemistry,2018, 90: 4916–4924.），利用筛选出的多肽结合分子修饰的金纳米颗粒进行心肌肌钙蛋白的比色法和电化学检测，并细致分析了纳米颗粒的大小和浓度，以及外加电压对检测限的影响（Analytical Chemistry,2016, 88, 11924-11930;ACS Sensors,2016, 1, 1416-1422；Nanoscale2015, 7, 17244-17248.），同时利用了智能手机作为光谱检测平台进行便携检测（Biosensors and Bioelectronics2018, 99, 312-317；Analyst,2016, 11, 3233-3238.）。

本文由我亦是行人编译。

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