【NS精读】水凝胶如何变得更像生物组织？——增加材料维度

背景

水凝胶是一种含水量丰富的聚合物网络，能够模拟细胞外基质环境，是常见的细胞体外培养和实验材料。然而，天然的细胞外基质不仅具有三维结构，还表现出随时空维度进行变化的动态特性，是一种名副其实的“四维”材料。作为其人工模拟物，水凝胶的“使命”就是要无限接近于细胞外基质，因此创造具有可时空操控的四维水凝胶一直是人们追求的目标。

图1细胞外基质（左）和水凝胶（右）（来源：左-网络，右-Materials Views）

实际上，目前已经有许多先进的生物材料实现了随时间（第四维度）变化的特性，例如对环境信号敏感的刺激响应材料、形状记忆聚合物以及可降解材料等。近年来的研究也逐渐实现了在水凝胶中对具有生物活性的小分子或者简单比较简单的多肽进行图案化，并成功引导细胞完成诸如粘附、扩散之类的简单功能。然而，为了使水凝胶更接近于细胞外基质从而推进其在药物递送、细胞行为研究等领域的发展，必须赋予水凝胶完成复杂细胞功能的能力。因此，光是链接多肽或者小分子是不够的，更需要键连氨基酸序列完整的蛋白质（全长蛋白质）。然而，对于此类结构复杂的蛋白质，如何在水凝胶中保持活性并实现第四维度的控制目前来说都是一项巨大但诱人的挑战。美国华盛顿大学的DeForest（通讯作者）团队近期发展了一种带有位点特异性修饰蛋白质的水凝胶，在保证全长蛋白质活性的同时还能实现四维光图案化。

图2Nature Materials刊发了DeForest关于四维水凝胶的最新工作

最大限度地保留全长蛋白质的生物活性

水凝胶技术发展至今之所以还未实现对全长蛋白质的整合和功能控制，是因为全长蛋白质结构复杂、十分脆弱，需要利用合适化学方法和精准的位点改性将其锚定到水凝胶的聚合物网络中。更重要的是，键连锚定之后的水凝胶必须保持稳定性和活性，以便其发挥正常的生物功能。为了达到这些要求，水凝胶与蛋白质之间的锚定必须是可控的——对蛋白质的键连修饰必须是特异性的，不应破坏蛋白质的结构和活性。然而，现有的方法是利用氨基酸残基上的巯基或者氨基通过非特异性反应将具有键连活性的基团修饰到蛋白质上，容易形成多类型的改性物，导致蛋白质去折叠并失去活性。

图3STEPL原理示意图（a）；五种带有活性基团的聚甘氨酸探针分子（b）

为了解决这一问题，DeForest等人采用新型的分选酶标记增强型蛋白质连接技术（STEPL）来一步实现蛋白质的功能化改性和纯化。在STEPL中，分选酶（Sortase A）全通过特异性识别全长蛋白质中的目标氨基酸分选酶来融合形成单一蛋白质构造，之后在钙离子的介导下，带有氨基端和活性基团（如醛基）的探针分子（如聚甘氨酸）亲核取代分选酶形成带有活性位点的改造蛋白质，游离的分选酶则被层析柱吸附分离，使得蛋白质得到纯化（图3）。由于利用STEPL，研究人员以6种蛋白质（EGFP、mCherry、mCerulean、EGF、bla、FGF）和5种聚甘氨酸类功能探针分子一共合成了30种高纯度的带活性位点蛋白质。

图4STEPL改造和NHS酯化改造的六种蛋白质的活性比较

成功合成带活性位点蛋白质后，研究人员检测了这种蛋白质的活性是否得到了保留。如图4所示，在六种蛋白质中，荧光检测表明，经过STEPL改造的荧光蛋白EGFP、mCherry以及mCerulean的荧光活性与未改造蛋白质几乎没有差别。比色检测则发现改造bla水解头孢菌素的能力也没有明显减弱。而改造EGF和FGF对细胞增殖的促进作用也得到了保留。而与STEPL相比，传统的N-羟基丁二酰亚胺（NHS）酯化改造蛋白质的方法则对蛋白质活性表现出了剂量依赖的减弱作用。

在水凝胶中固定全长蛋白质

确定了改造蛋白质的活性后，需要解决在水凝胶中可控锚定全长蛋白质的问题。研究人员首先利用应变促进的叠氮-炔烃环加成作用（SPAAC）合成了生物相容性良好的聚乙二醇（PEG）水凝胶。如图5a所示，这一水凝胶骨架聚合物上包含了基于羰基化合物（NIPPOC）光囚禁的烷氧基胺，在紫外辐照下，NIPPOC断键烷氧基胺被释放，而改造蛋白质取而代之与骨架聚合物进行肟键连接（oxime ligation）。由于需要检测水凝胶的图案化过程，因此研究人员利用具有荧光活性的改造EGFP（EGFP-CHO）作为模型蛋白。

图5在水凝胶中实现改造蛋白质的光图案化

在水凝胶中进行全长蛋白质图案化

之后，在光刻技术的帮助下，研究人员实现了凝胶厚度的掩膜形状可控化（图5a-f）。由于凝胶厚度对光强的影响，NIPPOC的光断键行为呈现出梯度变化的趋势，因此可以继而控制EGFP-CHO与水凝胶的连接，从而控制蛋白质的定位和浓度。在实现了蛋白质固定的可控三维图案化后，文章还研究了光释放蛋白质的可控图案化。首先，分选改造的mCherry蛋白质被均一地键连到水凝胶中，在光辐照下，蛋白质断键释放并被扩散出水凝胶，也能形成基于掩膜光刻技术的图案化。以上的过程实现了静态的三维图案化，而通过多种紫外波长的光辐照，不同的改造蛋白质经过多个释放-固定过程，则可以控制三维图案化随着时间进行复杂变化——即实现四维的动态图案化（图6）。

图6含有多种改造蛋白质的水凝胶在迭代的释放-固定过程中实现四维动态图案化

含有全长蛋白质的水凝胶引导复杂的细胞功能

在证明了水凝胶中的蛋白质可以在时空四个维度上被控制行为之后，研究人员终于着手检验是否可以通过控制蛋白质来控制复杂细胞功能的控制。首先，为了对引导细胞功能进行可视化，研究人员利用STEPL合成了EGFP-EGF改造蛋白质。之后，研究人员将具有荧光活性的EGFP-EGF链接到水凝胶中，通过动态EGF刺激对EGF的促增殖活性进行图案化。作为模型细胞，A431细胞被固定到水凝胶上。如图7a和b所示，EGFP-EGF能够促进细胞的增殖，特别是在图案化区域，细胞的密度是非图案化区域的两倍多，显然证明了水凝胶图案化能够控制细胞的增殖这一复杂的细胞功能。而图7c和d则表明，研究人员可以光释放蛋白质至指定区域（如细胞的一侧），表明在动态水凝胶中对细胞功能的控制可以达到单细胞的水平。

图7利用EGFP-EGF改造蛋白在水凝胶中控制细胞增殖

参考文献：

Bioactive site-specifically modified proteins for 4D patterning of gel biomaterials. Nature Materials, 2019, 18, 1005-1014.

文献链接：

https://www.nature.com/articles/s41563-019-0367-7

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