南京大学J. Am. Chem. Soc.:通过酶介导的荧光反应和自组装实现可激活NIR荧光/ MRI双模态探针用于体内成像

【引言】

多模态分子成像探针对于生物医学和临床研究是至关重要的。例如，磁共振成像（MRI）和近红外（NIR）荧光协同组合的双模态成像探针，其中MRI可以产生具有无限组织穿透深度和高空间分辨率的解剖图像，而NIR荧光能够产生高灵敏度的图像。然而，大多数探针显示“始终在线”信号，可能导致肿瘤-背景比(TBR)较差，还不能有效地满足早期诊断恶性肿瘤的需求。小分子基可激活探针具有明确的化学结构以及较小的尺寸，使得它们能够渗透并扩散到肿瘤组织中以达到分子靶并被激活。但是，设计能够与肿瘤细胞相互作用且可以同时切换NIR荧光和MRI信号的小分子探针仍然具有挑战性。此外，小尺寸探针可导致从靶位快速冲洗进而降低肿瘤累积和TBR，对长期分子成像是不利的。因此，迫切需要一种新的策略来设计可激活荧光/MR双模态成像探针以提高其肿瘤渗透性和肿瘤积累。

【成果简介】

近日，南京大学叶德举教授课题组设计并合成了一种小分子基可激活NIR荧光/ MRI双模态探针，并通过酶介导荧光反应和原位自组装将其用于体内成像。该策略利用酶的催化活性增强了MR特性并增加了靶组织中的探针积累。使用碱性磷酸酶（ALP）作为模型酶，研究表明，可激活双模态探针能够实现皮下ALP阳性肿瘤的非侵入、高敏感和空间分辨成像以及NIR荧光引导的原位肝脏肿瘤的实时手术切除。该成果以题为"Activatable NIR Fluorescence/MRI Bimodal Probes for in Vivo Imaging by Enzyme-Mediated Fluorogenic Reaction and Self-Assembly"发表在国际著名期刊J. Am. Chem. Soc.上。

【图文导读】

图1 ALP激活的NIR荧光/MR双模态探针用于体内成像的示意图

(a) P-CyFF-Gd的化学结构、ALP介导的荧光反应和P-CyFF-Gd原位自组装成NPs的示意图；

(b) 提出的P-CyFF-Gd用于体内ALP阳性肿瘤细胞的NIR荧光/MR双模态成像的机制；

(c) 设计的非组装对照探针P-Cy-Gd的化学结构。

图2 P-CyFF-Gd的体外表征

(a) 与ALP（2 U/mL）在37 °C孵化指定时间后，P-CyFF-Gd（200 μM）的HPLC分析；

(b) 与ALP（2 U/mL）在37 °C孵化指定时间后，P-CyFF-Gd（200 μM）的DLS分析；

(c) 将P-CyFF-Gd（200 μM）与ALP（2 U/mL，37 °C）一起孵化30分钟后形成纳米粒子的TEM和AFM图像；

(d) 与ALP（0.1 U/mL，37 °C）孵化0-40分钟，P-CyFF-Gd（5 μM）的紫外-可见吸收光谱；

(e) 与ALP（0.1 U/mL，37 °C）孵化0-40分钟，P-CyFF-Gd（5 μM）的荧光光谱；

(f) 在Tris缓冲液中与ALP（2 U/mL）孵化0-40分钟后，P-CyFF-Gd (200 μM)的T₁加权MR图像和T₁值（0.5 T）；

(g) 用不同浓度的ALP孵化30分钟后P-CyFF-Gd（5 μM）的荧光光谱；

(h) 与胰蛋白酶、BSA、溶菌酶、ACP、ALP或ALP以及P-CyFF-Gd的抑制剂Na₃VO₄一起在Tris缓冲液中孵化后，P-CyFF-Gd的荧光光谱；

(i) 与胰蛋白酶、BSA、溶菌酶、ACP、ALP或ALP以及P-CyFF-Gd的抑制剂Na₃VO₄一起在Tris缓冲液中孵化后，P-CyFF-Gd的T₁加权MR图像。

图3 肿瘤细胞中ALP活性的成像

(a) 与P-CyFF-Gd（100 μM）孵化10-60分钟的HeLa细胞的NIR荧光成像；

(b) 与P-CyFF-Gd（100 μM）孵化1小时后，固定在HeLa细胞膜上的自组装纳米粒子的典型冷冻SEM图像；

(c) （b）图中红框区域放大的冷冻SEM图像；

(d) （c）图中红框区域放大的冷冻SEM图像；

(e) 与P-CyFF-Gd（100 μM）孵化1小时后，从活HeLa细胞膜上收集的自组装纳米粒子的TEM图像；

(f) 细胞沉淀的荧光（上）和T₁加权MR（下）图像；

(g) （f）图中细胞沉淀的平均荧光强度（红色）和T₁值（0.5T，黑色）的比较；

(h) ICP-MS分析Gd含量。

图4 携HeLa肿瘤的活体小鼠内源性ALP的双模态成像

(a) 小鼠接受P-CyFF-Gd（I）、P-Cy-Gd（II）或P-CyFF-Gd + Na₃VO₄（III）注射在0、1、2、4和8小时小鼠的纵向荧光成像；

(b) 小鼠接受P-CyFF-Gd（I）、P-Cy-Gd（II）或P-CyFF-Gd + Na₃VO₄（III）注射后，携HeLa肿瘤小鼠的T₁加权MR图像；

(c) 小鼠接受P-CyFF-Gd（I）、P-Cy-Gd（II）或P-CyFF-Gd + Na₃VO₄（III）注射在0、1、2、4和8小时小鼠的归一化荧光强度；

(d) 小鼠接受P-CyFF-Gd（I）、P-Cy-Gd（II）或P-CyFF-Gd + Na₃VO₄（III）注射后，携HeLa肿瘤小鼠的最大信号增强（% SE）；

(e) P-CyFF-Gd（黑色）、CyFF-Gd（蓝色）和肿瘤裂解物（红色）的HPLC跟踪；

(f) 在注射到小鼠体内4小时后，HeLa肿瘤和主要器官中P-CyFF-Gd（红色）或P-Cy-Gd（蓝色）的生物分布。

图5 原位肝肿瘤的双模态成像和荧光引导手术

(a) 正常小鼠和原位HepG2/Luc肝肿瘤异种移植小鼠的全身荧光（下）和生物发光（上）成像；

(b) 原位HepG2/Luc肝肿瘤异种移植小鼠的T₁加权MR成像；

(c) 在肝脏直接喷洒P-CyFF-Gd（10 μM）30分钟后，成像引导手术切除原位HepG2/Luc肝肿瘤。

【小结】

本文中，作者报道了一种将酶介导的荧光反应与原位自组装相结合的新策略以设计小分子基可激活NIR荧光/ MRI双模态探针并将其用于ALP活性的实时体内成像。通过一系列体外和体内实验， ALP介导的荧光反应和P-CyFF-Gd自组装成单分散NPs得到实验验证。研究表明，鉴于NIR荧光和r₁弛豫率的同时增强，P-CyFF-Gd似乎适合于非侵入性地测量和定位活肿瘤细胞和活小鼠中的ALP活性。此外，P-CyFF-Gd成功应用于术中小鼠原位肝肿瘤边缘的定位，因而允许实时图像引导切除肝肿瘤。未来，该策略可用于设计具有NIR荧光和其他成像模态协同组合的可激活探针，以及用于癌症治疗诊断的药物递送控制。

文献链接：Activatable NIR Fluorescence/MRI Bimodal Probes for in Vivo Imaging by Enzyme-Mediated Fluorogenic Reaction and Self-Assembly(J. Am. Chem. Soc., 2019, DOI: 10.1021/jacs.9b03649)

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