无所不能 —— TEM 在水凝胶领域“玩”的也是非常溜的

【引语】

材料人现在设立各种文章专栏，所涉及领域正在慢慢完善，由此也需要更多的专栏作者，期待你们的加入，有意向的小伙伴直接微信联系cailiaorenVIP。不要再犹豫，下一个专栏创始人就是你。请记住：纵然你离我千里万里，我都在材料人等你！

水凝胶是一类在水中以物理交联或者化学交联形成的具有3D网络结构，含水量极高的软物质材料。水凝胶在生物医药方面具有很大的应用范围和前景。因此，对水凝胶的表征也显得尤为重要,特别是在超分子自组装水凝胶的组装结构表征上，TEM的应用十分广泛。下面就简单介绍一下有关TEM在水凝胶材料中的应用。透射电镜是一种高分辨率、高放大倍数的显微镜，是材料科学研究的重要手段，能提供极微细材料的组织结构、晶体结构和化学成分等方面的信息。透射电镜的分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～几十万倍。

一、TEM（普通透射电子显微镜）的在水凝胶材料的常见表征应用：

由于电子束穿透样品的能力低，因此要求所观察的样品非常薄，对于透射电镜常用75～200kV加速电压来说，样品厚度控制在100～200nm。要得到更多显微结构信息的高分辨率照片，一般需要场发射TEM。

1.TEM表征凝胶网络结构

通过TEM的表征，可以作为判断水凝胶材料的微观形貌和结构的一种重要依据，特别是在对于超分子自组装形貌结构的表征上，TEM表征是一种最直观的表征技术手段。

（1）凝胶微观三维网络的表征：

水凝胶是一类在水中以物理交联或者化学交联形成的具有3D网络结构材料。如图一，POG10-den分子是又POG10多肽链和PAMAM接枝得到的，他们与天然胶原蛋白一样可以成胶，POG10多肽链可以独立形成三重螺旋结构，但是PAMAM分子是树状的大分子网络，在水中形成球型组装体，因此，POG10-den加热下组装成胶，在水中主要呈现的是球型的组装聚集体(如图一左)¹，而天然胶原蛋白可以形成三重螺旋结构，其包含了由Gly-Pro-Hyp重复单元组成，进而自组装形成纤维，最终相互缠结互穿形成三维的凝胶网络（图一中）¹。RSF/HPMC9（再生丝/羟丙基甲基纤维素）体系水凝胶拥有优越的力学性能，拥有较高的力学强度，抗压模量达到1MPa以上。作者由此提出了一种可能的凝胶化机理，即HPMC分子与RSF分子之间的氢键和疏水相互作用可能对RSF/HMPC凝胶化行为产生协同作用。β-sheet的 RSF结构与HPMC之间的协同氢键作用形成了相互缠结的致密的交联网络（如图一右）²，这对力学性能的提高起了关键作用。

图一：

POG10-den分子的组装结构聚集体（左），天然胶原蛋白形成的凝胶三维网络（中），RSF/HPMC9体系的凝胶三维网络结构（右）。

（2）微观自组装结构的表征以及自组装结构的演变过程或者机理表征研究：

超分子自组装结构形貌一般有纳米带、纳米纤维、纳米管、纳米线、纳米片、胶束球等。下面我们简单介绍了易于形成凝胶两种典型纳米结构形貌。I3QGK短肽分子链在水中主要是β-sheet构像主导，在水中易于形成均一细长的纳米带结构（如图二左）³，I3QGK纳米带是相对刚性的，其扭曲和/或螺旋的迹象相当有限，可能是由于Q氨基酸残基的影响导致其β-sheet结构控制短肽分子形成平而长的纳米带结构。另外，类似的。利用开环聚合的方法得到的(G-EA)m-Tyrn短肽分子也通过自组装形成了细长的纳米纤维的结构形貌（如图二右）⁴，进而相互缠结形成凝胶网络。此外，超分子自组装结构有时对某一因素具有依赖性，比如自组装结构会随着某一因素（如pH、温度、时间等）的变化而改变，由此，TEM的表征显得尤为重要，它的表征可以跟踪表征每个时间段的某一时刻的组装结构，从而清晰直观的了解自组装结构的额演变或生长过程，进而外围是什么意思 于超分子自组装体系的机理研究。如图三所示⁵，比较清楚的表征了样品自组装结构随某一因素pH变化而变化的演变过程研究。即混合末端含两亲性肽后的DNA-和PNA(肽核酸)-在1、5、7天的演变过程，从第一天生成的有节距的纳米纤维丝对结构随时间的变化的趋势，组装结构逐步生长成为到第七天的纳米纤维束。

图二：直观的表征小分子水凝胶微观自组装结构：纳米带（左）、纳米纤维（右）

图三：第一天的有节距的纳米纤维丝对结构随时间的变化的趋势，组装结构逐步生长成为到第七天的纳米纤维束。

2.TEM表征凝胶体系微观形貌尺寸

利用TEM的质厚衬度像（吸收衬度像）可以对样品形貌进行表征，其中就包括样品形貌的尺寸的大小、分布、排列等。如图四左⁶，KE-F8多肽由于F（苯丙氨酸）氨基酸强烈的π-π相互作用，使得多肽主要呈现β-sheet结构，两周后。多肽水溶液通过自组装形成了更长的扭曲的纳米带结构，通过测量，清楚的表征出纳米带的宽度范围在25-34nm。另外，YYAYY短肽中利用Y（酪氨酸）氨基酸中的侧链基团的苯酚结构在催化作用下进行交联作用，从而使得短肽分子自组装形成了球型纳米凝胶结构（如图四中、右）⁷，通过TEM的表征和测量，中间的是TEM的大范围的显示图，可以看到大量结构均一分布较为均匀的球型纳米凝胶结构，进一步的小范围高分辨的TEM图（右图）测得其球型纳米凝胶的平均粒径在200nm。当然，对于平均粒径一般可以进行多点多次统计测量计算得出。

图四：左图表征纳米纽带的宽度尺寸范围为25-34nm，中、右两图表征纳米凝胶的直径尺寸约为200nm。

二、透射电镜（TEM）的特殊应用

1、冷冻透射电镜（Cryo-TEM）

2015年，国际著名期刊《自然》旗下子刊Nature Methods就将冷冻电镜技术评为年度最受关注的技术。2017年，冷冻电镜（Cryo-TEM）斩获诺贝尔化学奖，也再次证明了Cryo-TEM技术的科学价值。国内冷冻投射技术大牛施一公曾言，就目前发展前景来看，冷冻电镜技术是可与测序技术、质谱技术相提并论的第三大技术！Cryo-TEM通常是在普通透射电镜上加装样品冷冻设备，将样品冷却到液氮温度（77K），用于观测蛋白、生物切片等对温度敏感的样品。通过对样品的冷冻，可以降低电子束对样品的损伤，减小样品的形变，通过对运动中的分子进行冷冻，即可进行高分辨成像，从而得到更加真实的样品形貌。

C16-K2两亲性多肽链由于K（赖氨酸）氨基酸的侧链基团氨基可以质子化和去质子化作用，使得该多肽分子具有一定的pH响应性，从而使得该多肽分子约在pH=7.5一下容易自组装形成球型胶束结构，而在弱碱性环境pH=8附近主要形成细长的纳米纤维结构，pH大于8.3，其自组装结构主要会形成双分子层的纳米带状结构。如图五⁸，直观的表征自组装结构随某一因素pH改变而导致组装体结构趋势变化过程和真实形貌，(a) pH值为5时，只观察到球形胶束结构。(b) pH值为8时溶液显示细长的纳米纤维结构(红色箭头)。 (c)在pH值9时，可以观察到扁平的带状结构，同时也有迹象表明长纤维(红色箭头)类似于pH值8时形成的纤维。

图五：随pH变化而使得自组装从pH=5的胶束球状结构变成pH=8的纳米纤维丝状结构再到pH=9的纳米带状结构。

2、高分辨透射电子显微镜（HR-TEM）

HR-TEM只是分辨率比较高，是透射电镜的一种。它可将将晶面间距通过明暗条纹形象的表示出来。通过测定明暗条纹的间距，然后与晶体的标准晶面间距d对比，确定晶型。这样很方便的标定出晶面取向，或者材料的生长方向。主要应用有：①晶体缺陷分析。广义的讲，一切破坏正常点阵周期的结构均称为晶体缺陷，如空位、位错、晶界、析出物等。这些破坏点阵周期性的结构都将导致其所在区域的衍射条件发生变化，使得缺陷所在区域的衍射条件不同于正常区域的衍射条件，从而在荧光屏上显示出相应明暗程度的差别。②组织分析。除了各种缺陷可以产生不同的衍射花纹外，各种不同的晶体微观组织也会对应有不同的像和衍射花纹，通过它们可以在观察组织形貌的同时进行晶体的结构和取向分析。

如图六（上，d,e）⁹以芦荟叶凝胶制备碳量子点（CQDs），作者制备了粒径范范围为1.5nm-3.7nm，水动力直径为2.67nm的球型CQDs，通过HR-TEM的表征，图六上(d)和(e)为均匀间距为0.18 nm的CQDs晶格条纹图像，对应于石墨碳的(100)衍射面。另外，如图六（下，e,f）¹⁰，作者通过生物合成的方法制备纳米银粒子（BSN），从图六下e图可以看出，合成的BSN具有良好的分散性，多为十面体和二十面体形状的球形结构。图六下f图给出了一个具有十面体形状的纳米颗粒。

图六：

上图（d, e）为CQDs的HR-TEM图，晶格条纹间距0.18nm，下图（e, f）为BSN粒子的HR-TEM图，晶型多为十面体和二十面体形状的球形结构。

参考文献

1.Kojima, C.; Suehiro, T.; Tada, T.; Sakamoto, Y.; Waku, T.; Tanaka, N., Preparation of heat-induced artificial collagen gels based on collagen-mimetic dendrimers.Soft Matter2011,7(19), 8991.

2.Luo, K.; Yang, Y.; Shao, Z., Physically Crosslinked Biocompatible Silk-Fibroin-Based Hydrogels with High Mechanical Performance.Advanced Functional Materials2016,26(6), 872-880.

3.Chen, C.; Zhang, Y.; Fei, R.; Cao, C.; Wang, M.; Wang, J.; Bai, J.; Cox, H.; Waigh, T.; Lu, J. R.; Xu, H., Hydrogelation of the Short Self-Assembling Peptide I3QGK Regulated by Transglutaminase and Use for Rapid Hemostasis.ACS applied materials & interfaces2016,8(28), 17833-41.

4.Liu, R.; Shi, Z.; Sun, J.; Li, Z., Enzyme responsive supramolecular hydrogels assembled from nonionic peptide amphiphiles.Science China Chemistry2018.

5.Freeman R , Han M , Álvarez, Zaida, et al. Reversible self-assembly of superstructured networks[J]. Science,2018.

6.Zhou, P.; Deng, L.; Wang, Y.; Lu, J. R.; Xu, H., Different nanostructures caused by competition of intra- and inter-beta-sheet interactions in hierarchical self-assembly of short peptides.J Colloid Interface Sci2016,464, 219-28.

7.Min, K. I.; Kim, D. H.; Lee, H. J.; Lin, L.; Kim, D. P., Direct Synthesis of a Covalently Self-Assembled Peptide Nanogel from a Tyrosine-Rich Peptide Monomer and Its Biomineralized Hybrids.Angew Chem Int Ed Engl2018,57(20), 5630-5634.

8.Gao, C.; Li, H.; Li, Y.; Kewalramani, S.; Palmer, L. C.; Dravid, V. P.; Stupp, S. I.; Olvera de la Cruz, M.; Bedzyk, M. J., Electrostatic Control of Polymorphism in Charged Amphiphile Assemblies.The journal of physical chemistry. B2017,121(7), 1623-1628.

9.Sarkar, N.; Sahoo, G.; Das, R.; Prusty, G.; Swain, S. K., Carbon quantum dot tailored calcium alginate hydrogel for pH responsive controlled delivery of vancomycin.Eur J Pharm Sci2017,109, 359-371.

10.V, P.; S. E, N., Fabrication of a versatile chitosan nanocomposite hydrogel impregnated with biosynthesized silver nanoparticles using Sapindus mukorossi: characterization and applications.RSC Advances2016,6(98), 95564-95573.

本文由材料人滚球体育 顾问风雪供稿，材料人编辑部Alisa编辑。

欢迎大家到材料人宣传滚球体育 成果并对文献进行深入解读，投稿邮箱: tougao@cailiaoren.com.

投稿以及内容合作可加编辑微信：cailiaorenVIP.