丹麦技术大学ACS Nano : 脂质体负载多种生物制剂，靶向刺激哺乳动物雷帕霉素信号通路保护视网膜神经

【引言】

视神经病（如青光眼等）是不可逆失明的主要原因，视神经病变的常见原因包括视神经（ON）和视网膜中RGC轴突的丢失和RGC的死亡。之前研究表明，哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路激动剂在视神经损伤的动物模型中能促进轴突再生和RGC存活。然而，在开发利用细胞生长和组织重塑的治疗方法过程中仍存在许多困难与挑战。

对于临床转化应用，结合刺激mTOR通路的生物制剂用于RGC 神经保护需要进行修饰，以在对细胞途径调节（即，启动子，抑制剂，诱导剂，激动剂和拮抗剂）递送，释放，清除和驻留时间的有更好控制。纳米载体能够（例如，微载体，脂质体等）递送多种细胞途径调节剂同时控制调节剂释放，保护敏感货物免于降解，减少清除机制的影响并改善生物屏障对货物的吸收。脂质体含有胆固醇的磷脂囊泡是视网膜疾病的一种有利的传递系统，能负载疏水和亲水分子，在眼内（玻璃体内或视网膜下）注射后延长眼内保留，保护药物延缓变质，并有临床批准的历史。载有多种细胞通路生物制剂的脂质体以前没有被报道用于CNS 神经保护和再生。

【成果简介】

近日，丹麦技术大学的Andrew J. Urquhart课题组构建了一种负载多种刺激mTOR通路的生物制剂的脂质体，旨在增强视网膜损伤后的神经保护作用。该研究发表于ACS Nano(DOI:10.1021/acsnano.8b00596)。该研究中，脂质体负载有睫状神经营养因子，胰岛素样生长因子1，脂肽N-片段骨桥蛋白模拟物，以及用于ATP结构域或c-末端尾部的脂肽磷酸酶张力同源物抑制剂。装载有多种细胞途径调节剂的脂质体，具有将调节剂同时递送至细胞微环境的优点，促进对单细胞或多细胞途径的协同作用。此外，只需要非常低的浓度的信号通路调节剂通常就能达到非常有效治疗效果。这减少了对高分子药物负载的需要，并且最大化可用于将一系列治疗性小分子：肽和蛋白质包装到脂质体中的空间。

作者首先以棕榈酰（C₁₆）缀合的肽（即脂肽）C₁₆-OPP ，C₁₆-PAP2和C₁₆-PAP4为原料合成了三种脂质体LipA、LipB和LipC（图1 A)，并用HPLC进行了纯化，然后对脂质体的粒径、zata电位等进行了表征（图1 B、C)，以确保载药的脂质体能具有低毒性以及能在眼球玻璃体能顺利扩散。

图1 原理示意图及脂质体表征

（来源：ACS Nano）

接下来作者测定了视网膜类器官（小鼠胚胎干细胞（MES）分化的视网膜细胞组织体）对于脂质体的摄取和相关药代动力学结果。结果显示LipA比LipB、LipC有更好的摄取效果(22.6 %)（图2 A）；为了确定脂质体摄取是否与特定细胞类型相关，作者测定了五种视网膜类器官细胞类型的的摄取情况，发现并无明显差异存在（图2 B）。

图2 视网膜类器官中脂质体的摄取

（来源：ACS Nano）

为了探索载药脂质体对于视网膜功能的影响，作者用N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱导小鼠视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cell：RGC）死亡进行造模，然后分别向眼球玻璃体注射了三种脂质体，4周后通过视网膜电图（ERG）评估小鼠的视网膜功能，证实20mM浓度的玻璃体内注射不会导致光感受器损伤，Lip A对中间神经元和双极神经元细胞具有显着的保护作用，但对RGC具有混合作用。相反，Lip B对中间神经元和双极细胞没有显示出显着的保护作用，但表明对RGC具有保护作用。

图3. 空白与造模小鼠的视网膜电图振幅值

（来源：ACS Nano）

为了评估单次玻璃体内注射三种载药脂质体对NMDA诱导RGC死亡后宿主RGC存活的影响，作者对视网膜整体支架进行了RBPMS染色并在共聚焦显微镜上成像（图4 A B C）。通过计算图中RGC细胞存活数量与健康组进行对照（图4 D），显示Lip C不具有神经保护作用，Lip A或Lip B治疗不能完全防止RGC损伤。

图4. NMDA诱导小鼠视网膜损伤后注射三种脂质体对于 RGC的保护作用

（来源：ACS Nano）

为了进一步加强治对于RGC的治疗效果，作者选择了注射脂质体与RGC移植相结合的方法，移植后4周通过视网膜电生理功能和供体细胞存活评估疗效。结果表明（图5 A B C），脂质体A（Lip A）以改善宿主STR振幅的方式支持RGC移植, 细胞生长信号通路的激活和其他视网膜细胞类型（例如，无长突，双极等）的保护可能对移植RGC恢复宿主组织功能至关重要。

图5. 经过载药脂质体和移植RGC（tRGC）治疗的暗适应小鼠的视网膜电图振幅值。

（来源：ACS Nano）

此外，作者还通过RBPMS染色和共聚焦显微镜评估组合治疗对宿主RGC存活的影响（图6 A B C D），结果显示Lip A和Lip C组中观察到移植RGC的存活，且与先前关于移植细胞的报道相比存活时间更长，损伤后移植细胞存活和宿主RGC的死亡情况而得到改善。

图6.移植RGC和宿主小鼠的存活情况以及移植RGC的共聚焦图

（来源：ACS Nano）

以上这些结果说明，单次脂质体玻璃体内给药能够降低RGC死亡和视网膜电生理功能的丧失。此外，将脂质体与诱导的多能干细胞衍生的RGC移植相结合，能改善小鼠的眼球电生理学。这些结果显示,携带多种以上信号传导通路调节剂的脂质体可促进神经保护和改善移植后电生理学状况。

该项研究为视神经病的治疗提供了新的思路和方法。下一步，该团队将进一步探索该方法的剂量动力学（例如，调节剂浓度，调节剂组合，注射次数，注射之间的时间等），有望将此技术转化为临床可行的视神经病治疗方法。

论文地址：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.8b00596

本文由黄浠桐供稿。

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