十一篇文章带你初步了解DNA纳米技术的发展历程

自DNA的双螺旋结构发现以来，我们印象中的DNA就是这样的：

可如今，DNA还可以是下面这样的：

这就是通过DNA纳米技术得到的图形。

DNA纳米技术是一种多学科交叉的研究领域，主要利用DNA（脱氧核糖核酸）尺寸为纳米级别、刚性结构、编码性强的特点来构造各种纳米结构，应用于生物医学、化学、材料等领域。DNA纳米技术的发展刷新了人们对DNA这一生物大分子的认识，它不仅仅能作为生命遗传信息的载体，还能够作为纳米结构的构建工具。自1982年以来¹，DNA纳米技术经历了近40年的发展，最初出现是的Tile组装，从简单DNA十字结构到DNA结构模块构建百家争鸣²，而使用Tile组装构建各种DNA纳米图形也得以实现^3-5，自此DNA纳米技术领域初步成型。2006年，DNA折纸术⁶的发现则宣示了该领域一个新纪元的开始， DNA纳米结构的构建更是得到了空前的发展^7-10。最近，人们已经能够实现复杂DNA图案可控自组装图形构建了¹¹，其图形之精确令人惊叹！本文将从DNA纳米构图的角度，以十一篇文献讲述DNA纳米技术发展过程中的问题解决之路，希望能带领读者对DNA纳米技术的发展有一个初步的了解！

开创篇

DNA纳米技术的鼻祖当属纽约大学的Ned Seeman教授了。1982年，纽约大学的Seeman教授首次提出了十字叉状的Holiday结构不同于常规的线状双链DNA，它多出了两个方向，可以作为结构单元用于合成更为复杂、尺寸更大的二维结构。只要通过合理的设计，使得四条单链之间的碱基互补配对具有唯一性，减少序列的对称性，就可以得到固定的、十字叉状的Holiday类似结构。倘若在该十字结构的四条臂的末端添加合适的粘性末端，即可实现将多个十字叉结构单元组装成较大的二维甚至三维复杂结构。次年，Seeman团队正式设计出了这种固定的十字结构，称为“四臂结”。一个四臂结被称为一个Tile，多个Tile可以通过粘性末端链接到一起，得到二维结构，从而开创了Tile组装。

小结：四臂结Tile 结构的成功构建及使用预示着DNA纳米技术黄金时代的到来，DNA不再只是单纯的生物大分子，还可以是纳米结构的构造工具。但此时的四臂结Tile结构相对简单，且四臂张开，具有较大的灵活性。存在产物结构无法预测的问题。若要构建更为多样的图形则需要开发更加坚固而稳定的Tile 结构单元。

发展篇

1993年，Seeman团队在四臂结基础上进行改进，将两股双螺旋结构并列排布，并在其内部引入交叉（crossover），形成一种更为稳定的Tile结构，称之为DX（Double Crossover），DX的类型有很多种，主要依据两个DNA双螺旋螺旋轴的相对方向是平行还是反平行的来进行区分。但由于实验证实，平行的DX在纳米构造中表现欠佳，故在后期广泛使用的都是反平行的DX分子。若交叉点中间间隔了偶数个半螺旋则称为DAE（Double Antiparallel Even），若交叉点间的半螺旋数目是奇数，则称其为DAO（Double Antiparallel Odd）。

小结：DX的成功构建，解决了多臂结灵活度高，组装产物结构不确定的弊端，为后期研究DNA纳米构图奠定了基础，但其结构的稳定性仍有待提高。

1998年，加州理工学院的Winfree团队在Wang Tile的启发下，首次使用DX作为结构基元组装出了带有条纹的二维平面网格结构，并且还使用原子力显微镜（AFM）证实了产物的存在，这项研究以题为“Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals”被发表在Nature杂志上。从此，DNA纳米技术也逐渐受到人们的关注。

小结：这项工作证实了DX可以用来构造二维平面结构，是DNA纳米构图的一个里程碑。但其依然存在组装形状尺寸不可控以及DX固有的结构稳定性的问题。另外，更复杂的三维结构的构造仍是当时面临的挑战。

2003年, 颜颢团队在四臂结和DX的基础上，将四臂结的每一条臂的单个双螺旋替换成含内部交叉的并排的双螺旋结构（也就是DX结构），从而开发出了一种十字Tile。其结合了四臂结和DX二者的优点，结构稳定性有所提高。

小结：这种十字Tile表现出更好的刚性，大大优化了组装结构的稳定性。

2005年，颜颢团队提出了一种有限尺寸DNA组装结构的构造方法，仅仅利用少量的几种带有粘性末端的Tile结构，就可以组装出设定尺寸的二维阵列图形。文中尝试了多种类型的Tile结构，都可以实现组装。

小结：这一成果证实Tile组装也可以实现有限尺寸图形的构造，为解决Tile组装产物尺寸不可控的问题提供了思路。但Tile组装结构产率低，对化学计量比要求较高也是尚待解决的问题。

进阶篇

2006年，加州理工学院的Rothemund开发了一种新的DNA自组装技术，称为DNA折纸术。他们选用噬菌体DNA M13mp18作为长链，然后用两百多条短的单链DNA通过碱基互补配对原则，将长链折叠成想要的二维图形。Rothemund团队使用这种方法得到了矩形、三角形、五角星和笑脸等多种平面图案。此外，这种方法构造的纳米图形具有很好的可寻址性，在合适的位置引入发夹结构还可以得到具有不同图案的二维图形。

小结：DNA折纸术只需要将长链和若干短链混合起来进行退火，就可以得到想要的组装结构，操作相对Tile组装更加容易，对各组分的浓度比例要求更低。另外，DNA折纸术可以得到的产物复杂度更高，不再是简单的一些规整的几何图形了。纳米组装结构的内部具有很多的交叉结构，大大增加了结构的稳定性，为其应用于其他各领域奠定了基础。同时，Rothemund还将6个三角形的图案组合成了一个大的六边形，这也为大图形的构建提供了思路。不得不说，DNA折纸术的发现让DNA纳米技术的发展有了一个很大的飞跃。

但本文仅仅使用DNA折纸术构建了一些对称的二维图形，对于不对称的或者三维的复杂不行的构造仍有待探索。另外，DNA折纸术相对与Tile组装的一点不足在于其受到长链长度的限制，对于构建尺寸较大的结构稍显困难。

2006年，当时还在上海交通大学的钱璐璐等很快就利用DNA折纸术“折”出了中国地图的图案，这也是利用DNA折纸术的方法构建的第一个不对称的纳米图形。

2008年，丹麦的Andersen E S等在此基础上更进一步，成功组装除了纳米尺度的海豚形状，并且海豚还具有一条可以运动的尾巴。

小结：这些成果都证明了DNA折纸术可以实现不对称图形的组装，甚至可以用于动态结构的构造中去。不过，当时所构建的图形仍然基于长为7000多bp的长链，因而尺寸不会很大。

2010年，颜颢团队意识到DNA折纸术是一种十分有潜力的自组装体系，但尺寸受限却是其一大痛点，如何突破长链长度的限制获得尺寸更大的组装图形是DNA折纸术的一大挑战。他们使用长为1140 nt的M13的一部分作为长链骨架与短链组装成了34 nm × 22 nm的小长方形，再用另一条长链将9个这样的小长方形连接起来，就可以得到尺寸扩大的图形。作者指出，若使用70 nm × 90 nm的长方形Origami来折叠像λDNA（45000 nt）（倘若可以得到的话），就可能得到尺寸到微米级别的超级DNA折纸结构。

小结：本文提出了一种扩大DNA折纸图形尺寸的思路，为后期关于Scale up Origami的研究给出了一种可选的方法。但是，这种方法依然需要特殊的长链，在一定程度上，对于某些尺寸较大的图形的组装依然会受到限制。

2011年，Seeman团队认为想要将DNA origami图形的尺寸进一步放大的一条思路就是将单个DNA origami等价于一个Tile单元，那么DNA origami Tile结构因其内部多交叉，实际上就是一个更大版本的DX （双交叉）。早期已有研究证明，DX是可以成功形成二维大尺寸晶体结构的，那么使用DNA origami理应也可以实现。遗憾的是，他们失败了。后来，他们通过改进，设计了一种十字形的DNA origami结构，实现了基于DNA origami 的二维结构的形成。

小结：这一方法实现了DNA 折纸用于二维晶体形成的零的突破，且构建了截至目前为止最大的二维DNA折纸结构。但是，这种方法得到的图形尺寸难以控制，对于一些有限尺寸的图形组装将不适用。此外，因每一个Tile在二维结构中的位置不确定，因而利用这种方法得到具有复杂图案的形状的研究难以实现。

2017年，钱璐璐团队采用了Scale up 方法中的另一种：分层组装。使用64种DNA折纸单元，先形成2×2的图形，再形成4×4的图形，然后形成8×8的图形，通过这种方法得到的最终图形的面积是Rothemund曾经折出的经典DNA origami的64倍，尺寸达到微米级别。他们将每一块DNA origami单元的边缘都进行精心设计，保证其能在特定的位置同特定的DNA origami 结合到一起，从而形成尺寸可控的结构。另外，他们还开发了相应的软件，可以将用户想要的图形转换成相应的带发夹结构的DNA链，从而实现了不同图案的大尺寸DNA折纸的自组装。

小结：本文提供了一种基于DNA折纸的、尺寸可控的大图形的通用组装方法，并且可以设计复杂的图案，真正实现了控制DNA折纸自组装形成用户指定的图案的二维图形。

结语：DNA纳米技术发展至今，已经可以组装出许许多多复杂的二维、三维甚至带有曲面的结构。其应用领域也涵盖了化学、生物医学、材料及物理等。几十年来，经过若干科学家的努力，让这一新兴领域逐步发展了起来，我们也期待未来DNA纳米技术将在各领域中大放异彩。

参考文献
1.Seeman N C.Nucleic acid junctions and lattices.J Theor Biol, 1982, 99: 237-247.
2.Fu T J, Seeman N C.DNA double-crossover molecules.Biochemistry, 1993, 32: 3211–3220.
3.Winfree E, Liu F, Wenzler L A, et al.Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals.Nature, 1998, 394: 539-544.
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7.Qian L, Wang Y, Zhang Z, et al.Analogic China map constructed by DNA.Chin Sci Bull, 2006, 51: 2973-2976.
8.Andersen E S, Dong M, Nielsen M M, et al.DNA Origami Design of Dolphin-Shaped Structures with Flexible Tails.ACS Nano, 2008, 2: 1213-1218.
9.Zhao Z, Yan H, Liu Y.A Route to Scale Up DNA Origami Using DNA Tiles as Folding Staples.Angew Chem, Int Ed, 2010,49: 1414-1417.
10.Liu W, Zhong H, Wang R, et al.Crystalline Two-Dimensional DNA Origami Arrays.Angew Chem, Int Ed, 2011, 123: 278-281.
11.Tikhomirov G, Petersen P, Qian L.Fractal assembly of micrometre-scale DNA origami arrays with arbitrary patterns.Nature, 2017, 552: 67-71.

本文由纳米组Jing供稿，欧洲足球赛事 编辑整理。

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